微生物对黄精酵素中酶活性动态变化影响的研
采用蒸制后的黄精，按照g蒸制黄精添加mL醋水（醋水比为1∶5），分别添加不同的菌种进行发酵，其中未添加微生物为对照组，在28±2℃下进行发酵。分别对比组间不同发酵阶段的甜度、pH值、抗氧化活性、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性。结果表明，在发酵14d后，甜度、酸度、淀粉酶和纤维素酶基本趋于平稳，蛋白酶和抗氧化酶有所下降，而菌种添加组中酶活性的差异不显著。因此，可以根据酵素的主要功效有针对地选择添加不同的菌种进行发酵。
本实验通过微生物发酵技术，用酵母菌、乳酸菌和醋酸菌及三者组合来发酵蒸制后的黄精，分别采用福林显色法、DNS显色法研究发酵过程中蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶的动态变化，并采用ABTS、FRAP、DPPH方法检测抗氧化活性，以便更全面地反映黄精酵素发酵过程中抗氧化活性的动态变化。测定黄精酵素中主要功效酶的活力，对于科学评价黄精酵素的质量指标，开发利用黄精酵素保健食品和化妆品等有重要的指导意义。为稳定黄精酵素口感，采用感官评价对黄精酵素的气味、甜度和酸度进行检测，找出最优发酵组合、口感一致的酵素产品，提高黄精酵素功能性食品的价值，利于后期扩大生产。
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材料与方法
（1）试剂
2,2′-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购买于Sigma-Aldrich公司；福林试剂、酪氨酸、葡萄糖、羧甲基纤维素钠；可溶性淀粉。
（2）实验原料
鲜黄精采自安化县阿丘中药材种植专业合作社，由湖南省中医药研究院谢昭明和刘浩鉴定为多花黄精，为版《中华人民共和国药典》一部所收载的品种。黄精的蒸制方式采用文献方法，蒸制九次。
（3）微生物培养基
乳酸菌（MRS）培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸三铵2g/L，乙酸钠·3H2O5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L,MnSO40.2g/L，吐温.5mL/L。
醋酸菌、酵母菌（LB）培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
以上液体培养基调节pH至6.2±0.2，固体培养基则在液体培养基加15g/L的琼脂粉。在℃、0.15MPa高温高压灭菌20min后备用。
（4）实验设备
UVB紫外可见分光光度计；PHS-3E酸度计；LB90T糖度计；Vortex-5振荡器；LDZX-75KRBS立式高压蒸锅；SW-CJ-1FD洁净工作台；H3-20K台式高速离心机。
（5）实验方法
黄精酵素制备工艺
黄精酵素发酵方案见表1。
表1黄精酵素发酵方案
糖度测定
采用LB90T糖度计对发酵液进行糖度测定，在菱镜上滴1-2滴待测的发酵原液，盖上保护盖，将糖度计水平对着光源，透过接目镜，读取明暗线交界的刻度，即为糖度。
pH测定
采用PHS-3E酸度计对发酵液进行pH测定，pH计校准后用蒸馏水冲洗电极，将电极放入待测的发酵原液中，待屏幕上显示的pH值稳定后，记录pH值。
抗氧化活性
ABTS法：取0.2mL样品加2.8mLABTS稀释液，反应20min后，在nm波长处测其吸光度，以无水乙醇作为空白对照，测其吸光度，计算每毫升样品的Trolox的当量；FRAP法：取0.2mL样品加2.8mL预热至37℃的FRAP试剂，反应30min后在nm波长处测其吸光度，以无水乙醇作为空白对照，测其吸光度，计算每毫升样品的Trolox当量；DPPH法：取0.2mL样品加2.8mLDPPH，暗处静置30min，nm波长处测其吸光度，以无水乙醇作为空白对照，测其吸光度，计算每毫升样品的Trolox当量。
酶活性检测
蛋白酶活性测定参照GB/T-中的福林法进行，淀粉酶活性测定参照GB/T-方法进行，纤维酶活性测定参照QB-方法进行。
数据处理与分析
实验结果以X±SD表示，采用Origin9.1软件对数据进行显著性分析，P
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实验结果与分析
（1）黄精酵素发酵过程中糖度变化
糖度能很好地反映酵素的发酵程度，是风味口感评价的重要指标。黄精酵素糖度随发酵时间的变化如图1所示。由图可知，不同组的初始甜度基本一致，0-7d间各组的糖度均呈现显著上升趋势，7-14d糖度缓慢上升，随后基本趋于稳定。而不同微生物添加组中发现乳酸菌和无微生物添加的黄精酵素甜度稍高，而添加醋酸菌和酵母菌的黄精酵素甜度稍低于其他组，这可能是微生物分解了黄精中的多糖形成单糖，使得酵素甜度随着发酵的进行有所增加，但不同微生物分解多糖的效率存在差异，因此各组间甜度存在一定差异。
图1黄精酵素发酵过程中的糖度变化
（2）黄精酵素发酵过程中pH变化
酸度能很好地反映酵素的发酵程度，是风味口感评价的重要指标。黄精酵素的pH随发酵时间的变化如图2所示。随着发酵的进行，酵素液的pH值降低，其中0-7d在所有添加了微生物组的pH值降低显著，而未添加微生物的对照组在7-14d其pH值显著下降，14d以后各组的pH值基本趋于平稳。从图中也可以看出添加乳酸菌组pH值最高，未添加微生物的pH值最低。
图2黄精酵素发酵过程中的pH变化
（3）黄精酵素发酵过程中抗氧化活性动态变化
分别采用ABTS、FRAP、DPPH三种方法对黄精酵素抗氧化酶活性进行检测，结果如图3。ABTS法测定黄精酵素的抗氧化活性随着发酵的进行，其抗氧化活性变化差异不大，以发酵第7d的抗氧化活性最高，其中添加醋酸菌的抗氧化活性最高。DPPH法和FRAP法测定则发现黄精酵素抗氧化酶活性随发酵时间的增加而增大，在发酵第7d时达到最大值，随后有下降趋势。其中FRAP法测定的抗氧化酶活性在黄精不同发酵阶段差异显著，DPPH法测定抗氧化酶活性动态变化不显著。而添加不同菌种的酵素其抗氧化酶活性差异不显著，不同测定方法中分别以单独添加醋酸菌中ABTS法和DPPH法中抗氧化酶活性最高，而FRAP法中则是同时添加三个菌种的抗氧化酶活性最高。
图3黄精酵素发酵过程抗氧化活性动力学研究
（4）黄精酵素蛋白酶活力发酵动力学研究
采用福林法对黄精酵素的蛋白酶进行测定，结果如图4所示。蛋白酶的活性在0-7d显著提高，第7-21d呈现缓慢下降趋势，21-28d蛋白酶活性较为稳定。其中以第7d添加乳酸菌的黄精酵素中蛋白酶活性最高，以第0d添加酵母菌发酵的黄精酵素中蛋白酶活力最低。
图4黄精酵素发酵过程蛋白酶活性动态变化
（5）黄精酵素淀粉酶活力发酵动力学研究
采用GB/T-方法对黄精酵素中淀粉酶活力进行测定。结果如图5所示，黄精酵素发酵过程中淀粉酶活力随着发酵的进行逐渐升高，第21d后基本趋于稳定，且同一发酵阶段不同组间淀粉酶活力基本一致，说明菌种对黄精酵素淀粉酶活力的影响不大。
图5黄精酵素发酵过程淀粉酶活性动态变化
（6）黄精酵素纤维素酶活力发酵动力学研究
采用QB-方法对黄精酵素中纤维素酶活力进行测定。结果如图6所示，黄精发酵过程中纤维素酶活力随着发酵的进行而缓慢提升，各组均在发酵第14d时纤维素酶活力达到峰值，随后下降，其中以加了酵母菌、乳酸菌和醋酸菌三种混合菌的发酵组在发酵第14d时纤维素酶活力最高，且不添加任何菌的对照组的纤维素酶活力在第7d和第14d均高于添加单一菌种组。各组在第21-28d其纤维素酶活趋于稳定。
图6黄精酵素发酵过程纤维素酶活性动态变化
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结论
本实验以黄精为原料，以糖度、pH值、抗氧化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维酶活力为指标研制黄精酵素。结果表明：0-14d之间，糖度、抗氧化活性、淀粉酶和纤维素酶活力均随着发酵时间的延长而增加，pH则随着发酵时间的延长而降低，蛋白酶则是在发酵第7d时达到高峰，随后下降。在发酵14d后，甜度、酸度、淀粉酶、纤维素酶基本趋于平稳。结合风味分析发现，发酵14d左右口感并未达到最佳，酵素的颜色也较浅，口感较酸；发酵28d后酵素的颜色越来越深，口感酸甜，且添加乳酸菌的发酵组口感最甜，有浓郁的黄精气味，过滤后无需调味可直接食用。
从添加不同微生物组来看，甜度较高的为乳酸菌添加组，pH值较高的为乳酸菌组和三种菌混合组，抗氧化活性则因测定方法不同而存在差异，其中醋酸菌在ABTS法和DPPH法抗氧化酶活性最高，蛋白酶以乳酸菌组最高，淀粉酶各组间差异不大，而纤维素酶则以三种菌混合组最高。蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和抗氧化酶具有很好的抗衰老和清洁功能，因此，可以根据酵素面向的人群，以及各种不同酶的作用功效，有针对地选择添加不同的菌种发酵黄精酵素原料，定向开发不同功效的保健食品和化妆品等。
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