北五味子麦芽酵素发酵工艺酶解麦芽的糖化

以北五味子和大麦芽为原料，采用酵母菌为发酵剂，以总多酚含量和SOD酶活力为指标，通过单因素试验和正交试验确定北五味子麦芽酵素的最佳发酵工艺条件。结果表明，大麦芽与北五味子质量比1︰5、发酵温度28℃、接种量0.8%、发酵时间3d,在该条件下，SOD酶活力为.79U/mL，总多酚含量为.03mg/mL。该酵素的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS+自由基清除率较高，分别达到94.50%，98.09%和0.mmol/L，说明通过酵母菌发酵制备的北五味子麦芽酵素具有较好的抗氧化活性。北五味子药用价值较高，是滋补性中药，列入卫计委公布的可用于保健食品的物品名单；大麦营养成分丰富，发芽后不但保留其本身的各种营养成分，而且还形成非常丰富的酶系。试验以北五味子和大麦芽为原料，以酵母菌为发酵剂，制备北五味子麦芽酵素，并对其SOD酶活性、总多酚含量以及体外抗氧化活性进行测定，以期为北五味子麦芽酵素产品开发与生产提供理论依据。材料与方法…1●材料与试剂北五味子、大麦芽（均为市售）；RV葡萄酒活性干酵母；PectinexUltraColor果胶酶；SOD酶活力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）；福林酚试剂；无水碳酸钠、维生素C、邻苯三酚、过氧化氢、硫酸亚铁等。2●仪器与设备WS手持式折光仪；HR打浆机；电热恒温水浴锅；TD5Z低速平衡离心机；DL-CJ-1N超净工作台；EX电子分析天平；DRP-电热恒温培养箱；UV-紫外可见分光光度计。3●工艺流程与操作要点工艺流程操作要点酶解：北五味子破碎后，添加PectinexUltraColor果胶酶进行酶解，果胶酶添加量2.0mL/kg，置于50℃水浴中酶解2h，过滤后的滤汁可溶性固形物含量8%，备用。麦芽的糖化：用磨粉机磨粉，过40目筛，浸入38～40℃温水（粉水比1︰3）中浸泡40min，升温到52℃下浸泡30min。随后将温度控制在63～65℃左右，保持60min，调节温度78℃，维持20min灭酶，用目筛网过滤，冷却备用。杀菌：采用超声波杀菌方式对其原料进行杀菌。将按一定比例配好的麦芽汁与北五味子酶解液，在W超声波下处理15min后，冷却至室温后接种。活化与接种发酵：按照酵母粉与蒸馏水质量比1︰10溶解高活性干酵母，放置在32℃恒温水浴锅中活化30min，菌数3.2×CFU/mL，备用。在无菌室内，按试验设计比例，接入活化好的酵母菌液，在不同温度和时间等条件下进行发酵。在发酵过程中和结束后分别测定该酵素产品的总多酚含量、SOD酶活及其抗氧化活性的变化。单因素试验麦芽与北五味子比例的选择：在酵母菌接种量0.6%、发酵温度28℃、发酵时间3d条件下，考察麦芽汁与北五味子酶解液不同比例（1︰1，1︰2，1︰3，1︰4，1︰5和1︰6）对酵素液中SOD酶活性和总多酚含量的影响，确定最适的麦芽汁与北五味子酶解液配比。发酵时间的确定：选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1︰5，原料进行处理后，酵母菌接种量0.6%，在28℃下发酵，分别在1～5d时测定其总多酚和SOD酶活力，确定酵母菌的最适发酵时间。发酵温度的确定：选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1︰5，原料进行处理后，酵母菌接种量0.6%，分别在22，25，28，31和34℃条件下进行发酵3d，测定其总多酚和SOD酶活力，确定酵母菌最适发酵温度。接种量的确定：选择麦芽汁与北五味子酶解液比例1︰5，原料进行处理后，发酵温度设为28℃，酵母菌接种量分别为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%，发酵3d，测定其总多酚和SOD酶活力，确定酵母菌最适接种量。正交试验在单因素试验的基础上，以总多酚含量和SOD酶活力作为评价指标，采用L9(33)正交表来进行正交试验，以确定其最佳的发酵工艺参数。因素水平见表1。表1因素水平表指标测定总多酚含量测定：采用福林酚法进行测定。称取1mL标准液或样品稀释后，加入1mL福林酚试剂及3mL20%Na2CO3，摇匀，于50℃恒温水浴锅中反应30min，在nm波长下测定吸光度。重复3次，取平均值，根据标准曲线计算样品中总多酚的含量。总多酚标准曲线回归方程为：y=0.x+0.，R2=0.。SOD酶活力的测定：将酵素液以r/min离心10min后，按照SOD酶试剂盒说明书具体标准，进行酶活力的测定。ABTS自由基清除能力的测定：按照试剂盒中说明书所标注的方法进行试验测定，根据已知的标准曲线y=-1.x+1.(R2=0.）计算出清除能力，其中，y代表其抗氧化能力，x代表吸光度。羟自由基清除能力的测定：取0.1mL样品，加入2mL6mmoL/L的过氧化氢溶液以及FeSO4溶液，摇匀静置10min后，加入2mL6mmoL/L的水杨酸溶液，摇匀，放置37℃恒温水浴中1h，在波长nm下测定吸光度A1。以去离子水为参比溶液，测定吸光度A0，以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液，测定吸光度A2。DPPH自由基清除能力的测定：将样品溶液稀释后，在试管中加入2mLDPPH乙醇溶液及2mL稀释后溶液。混合均匀后在25℃条件下，避光放置30min，于nm波长下用无水乙醇调零，测定其吸光度A1。空白对照以无水乙醇代替样液，测定吸光度A0，以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测定吸光度A2。结果与分析…1●麦芽汁与北五味子酶解液比例的确定由图1可以看出，SOD酶活力随着麦芽汁与北五味子酶解液比例增加至1︰5时，SOD酶活力最高可达.13U/mL，随着北五味子含量提高，SOD酶活力开始下降至最低为.42U/mL；从总多酚含量来看，同样在麦芽汁与北五味子酶解液1︰5时，其含量达到最高.85mg/mL。综合SOD酶活力与总多酚这2个指标，选择最适原料配比为麦芽汁与北五味子酶解液比例1︰5。图1不同麦芽汁与北五味子酶解液比例对酵素中SOD酶活力和总多酚含量的影响2●发酵时间对北五味子麦芽酵素的影响由图2可知，随着发酵时间延长，发酵液中总多酚含量逐渐增加，发酵第3天，总多酚含量达到最高，为.77mg/mL。发酵初始阶段，SOD酶活力呈上升趋势，第2天达到最高值为.13U/mL，随后呈下降趋势。可能是因为酵母菌的数量随发酵时间延长而逐渐增加，致使发酵液中氧气含量减少，从而导致酵母菌无氧发酵产乙醇速率增加。发酵第5天时，SOD酶活力和总多酚含量都降低。综合来看，确定酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最适发酵时间为3d，此时，总多酚含量为.77mg/mL，SOD酶活力为3.52U/mL。图2发酵时间对SOD酶活力和总多酚含量的影响3●发酵温度对北五味子麦芽酵素的影响由图3可知，发酵温度逐渐升高时，发酵液中SOD酶活力也呈上升趋势，发酵温度28℃时SOD酶活力达到最高，可达.37U/mL。发酵温度继续升高时，SOD酶活力开始下降，到34℃时SOD酶活力最低。发酵温度升高至28℃时，总多酚含量增加至最高值，为.19mg/mL。发酵温度继续升高时，总多酚含量开始减少。综合2个指标，确定酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最佳发酵温度为28℃，此时总多酚含量为.19mg/mL，SOD酶活力为.37U/mL。图3发酵温度对SOD酶活力和总多酚含量的影响4●接种量对北五味子麦芽酵素的影响由图4可知，酵母菌接种量由0.2%升高到0.8%时，总多酚含量逐渐增加并达到最大值，为.03mg/mL。随着接种量增加，SOD酶活力呈缓慢上升趋势；接种量0.8%时，SOD酶活力达到最高，为.79U/mL。接种量大于0.8%时，SOD酶活力和总多酚含量开始下降。因此，北五味子大麦芽酵素最适酵母菌接种量为0.8%，此时SOD酶活力为.79U/mL，总多酚含量为.03mg/mL。5●北五味子大麦芽酵素的工艺条件优化由表2可知，酵母菌发酵对北五味子大麦芽酵素SOD酶活力影响的主次顺序为ACB，发酵温度对SOD酶活力的影响最大，其次为接种量，发酵时间对SOD酶活力的影响最小；由K值可知，以SOD酶活力为指标时的最优组合为A2B2C3，即发酵温度28℃，接种量0.8%，发酵时间3d。对北五味子大麦芽酵素总多酚含量影响的主次顺序为ACB，发酵温度对总多酚含量影响最大，其次为发酵时间，接种量对总多酚含量的影响最小；由K’值可知，以总多酚为指标的最优组合为A2B2C3，即发酵温度28℃，接种量0.8%，发酵时间3d。因此，酵母菌发酵北五味子大麦芽酵素的最佳工艺条件为：发酵温度28℃，接种量0.8%，发酵时间为3d。在此条件下，酵素产品的SOD酶活力为.79U/mL，总多酚含量为.03mg/mL。图4接种量对SOD酶活力和总多酚含量的影响6●北五味子麦芽酵素抗氧化活性的测定由表3可以看出，发酵前后DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均略有下降，但是，羟自由基清除率有较明显上升，由原来的90.59%上升到98.09%，高于4mg/mL维生素C对羟自由基清除率，说明该酵素对羟自由基有较好的清除效果。这可能是由于酵母菌的代谢产物增加导致多酚升高的缘故。黄雨洋等研究结果表明，乙醇添加量在适合范围内，传质阻力小，多酚溶解性好，会使多酚得率和对羟自由基清除率增加。表3发酵前后清除自由基能力的变化结论…酵母菌发酵制备北五味子麦芽酵素的最优工艺条件为：大麦芽汁与北五味子酶解液配比1︰5、发酵温度28℃、接种量0.8%、发酵时间3d。在该条件下，SOD酶活力达到.79U/mL，总多酚含量达到.03mg/mL。该酵素的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS+自由基清除率较高，说明通过酵母菌发酵，可以制备总多酚含量与SOD酶活力较高且具有较好抗氧化活性的北五味子大麦芽酵素产品。分享、在看与点赞对话酵素，表达你的态度

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