蛋白系列课程蛋白质定量Lowry法

各就诸位，最先咱们的扮演吧！

前次和众人分享了卵白的索取的测验法子，那末拿到卵白样本后，怎么对此中的卵白质停止定量呢？今日就给众人分享一下卵白质定量的法子。

暂时操纵的卵白质定量的法子要紧有：Lowry法、考马斯亮蓝法（Bradford法）、BCA法、磺基水杨酸沉没法等。今日先给众人引见一下Lowry法。

Folin-酚法（Lowry法）最锐敏的卵白质测定法子之一，最先由Lowry肯定了卵白质浓度测定的根底环节。之后在生物化学畛域获得遍及的运用。

测验旨趣

碱性前提下，卵白质中的肽键和铜联结生成蓝色复合物（双缩脲反映），接着参与福林酚试剂（Folin-PhenolReagent），此中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被卵白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基复原，使得蓝色变成深蓝色，增长了显色量，从而抬高了探测卵白的敏锐性，在必定前提下，蓝色深度与卵白量成正比。

测验试剂

1．试剂甲：碱性铜溶液

10gNa2CO3,0.25gKNaC4H4O6·4H2O和2gNaOH，熔解于ml双蒸水中。

0.5gCuSO4·5H2O熔解于ml双蒸水中。

屡屡操纵前,将A与B以50:1搀杂，即为试剂甲。

2．试剂乙：福林酚试剂（2X）

3．牛血清卵白（BSA）

4．待测的卵白样本

测验环节

筹办1X的福林酚试剂，将2X的福林酚试剂用双蒸水稀释至1X。（1X的福林酚试剂不敷不变，设置后应尽管操纵）

设置不同浓度的准则卵白液（BSA）,1ug/ul,2.5ug/ul,5ug/ul,7.5ug/ul,10ug/ul，待测卵白样本在甚么溶液中，就用该溶液来稀释准则卵白液（如待测样本溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释准则卵白液）。

取各浓度的准则卵白液40ul参与96孔板中，另取待测的卵白样本40ul，参与96孔板。

向各孔的卵白液中参与ul的试剂甲（碱性铜溶液），混匀，室温静置10分钟。（此处尽管用排枪参与试剂甲，保证反适工夫类似）

静置终了后，用排枪向各孔中参与20ul的试剂乙，即时振动混匀30s，接着室温安放30分钟。（该环节搀杂速率要快，不然会使显色水平减轻）

用酶标仪测定波长nm处的吸光度，再将各个点的吸光度减去空白值，绘制准则弧线，从而计划待测样本的卵白浓度。

如图，以准则液的卵白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制准则弧线，从而计划待测样本的卵白浓度。

仔细事故

因反映形成的显色会持续地加深，以是各项职掌的工夫务必无误，如在参与试剂甲和试剂乙时，应尽管操纵排枪，从而使得反适工夫一致，假使没有排枪时，也应尽管管制混匀的工夫点，使得反适工夫尽管一致。其它，室温静置的工夫应当尽管无误。

准则卵白液的加量应当的确，假使加量禁止确，会致使制做出来的准则弧线呈现误差，影响待测样本的浓度计划，以是一方面需求用梯度稀释的法子来设置准则卵白液，另一方面应操纵无误度高的移液枪。

关于新手来讲，加样前也许如今纸上纪录下加样的循序，免得犯错。

由于Lowry法卵白定量法的卵白浓度和吸光度并不呈全部线性联系，绘制准则弧线的光阴假使是机械绘制，那末应当采用four-parameter(quadratic)orbest-fitcurve，功效比purelylinearfit更好，假使是手工绘制，不该该取舍linearfit（线性拟合），应当取舍用电和电（pointtopointcurve）直联贯线而成的弧线功效更好。

优弱点

长处：

1.法子罕用。

2.锐敏度高，较双缩脲法更锐敏。

弱点：

耗时较长

需求无误管制反适工夫

准则弧线不是严厉的直线式样

一心性较差，侵犯物资较多

“医学方”一直全力于效劳“医学人”，将最前沿、最有代价的临床、科研首创文章推送给诸位临床医生、科研人员

医学方已推出“测验室那些事儿”“SCI写稿技能”“文件细读与剖析”“医学英语轻便学”“国果然基金请求”“临床数据发掘”、“基因数据发掘”、“R语身教程”、“医学统计学”、“微创动物测验培训”等多个专题课程，如需熟悉课程详细推文，可

转载请注明：http://www.abuoumao.com/hyls/956.html